从条件组织培养基中产生和分离外泌体

术语外来体通常被理解为参考特定类别的脂质膜结合的细胞外囊泡(EV),其特征在于直径为40nm至150nm,密度为1.09g / ml至1.18g / ml。外来体参与各种细胞活动,并且已被证明可从多种体液中分离,包括唾液,尿液,血浆,血清,母乳和羊水,以及培养细胞的条件培养基[1]。事实上,外泌体可以从任何可培养的细胞类型中分离。已经证明纯化的外泌体在多种体外和体内模型中具有临床相关的治疗生物活性[2,3]。在诊断领域,从体液中分离的外泌体,尤其是血液,已证明其作为特定疾病的生物标志物的价值。在这篇文章中,

没有FBS的文化

牛血清含有丰富的外泌体。为了优化对感兴趣的外来体靶标的分析,最好从待收获的培养基中去除血清。大多数培养的细胞可以在无血清培养基中耐受24或48小时的生长(测试细胞的耐受性相对简单 - 在无血清培养基中孵育后检查细胞活力)。用含有血清的培养基建立培养物后,用大量无血清培养基清洗附着的细胞至少三次,然后向培养物中加入最少量的无血清培养基,再返回培养箱24小时。 48小时。得到的条件培养基将含有大量来自您感兴趣细胞的外泌体。你的细胞不能耐受24小时没有血清,

苯酚无红色介质

条件培养基的超速离心是分离外泌体的更常用的方法之一,特别是如果你有更大量的培养基(> 100毫升)。超速离心以沉淀外泌体后,尽管采用最严格的方法去除离心管中过量的培养基,但当将沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)或另一种透明缓冲液中时,通常会有一些培养基残留物。对于某些下游应用,特别是直接光度分析,即使少量的酚红也会影响您的读数。只要您用无酚红培养基洗涤和培养培养物进行调理和随后的外泌体分离,就可以接受含有酚红的培养基以促进细胞生长。

近似蛋白质和RNA量

你已经分离了你的外泌体,想要确定你有多少蛋白质和RNA。标准测量通常需要裂解步骤,并可能需要10 米升至100 米样品的升。实例包括用于测量蛋白质的标准Bradford测定法或用于记录外来体RNA水平的分光光度读数。在许多情况下,您的外泌体可能供不应求,或者最小体积小于100 m l。由于这些方法只是数量的近似值,因此最好使用NanoDrop ND-1000分光光度计等仪器,可直接测量1 m l至1.5 ml样本。然后,您将获得更多珍贵的外泌体材料,可用于进行功能或生化分析。

相关性可能很棘手

虽然确实有更多的细胞会导致更多的外泌体分离,但特定的外泌体数量似乎并不具有一致的总蛋白质或RNA含量。尽管控制细胞数量和传代,培养基体积和培养时间,但缺乏可预测性似乎在相同和不同细胞类型内和跨越相同和不同细胞类型。即使有来自至少20个原代细胞和细胞系的条件培养基的数百个外泌体分离的经验,这些参数之间的可预测的相关性也是难以捉摸的。当比较同一实验室内不同批次的外泌体以及将结果与其他实验室的结果进行比较时,这可能会带来挑战。在比较不同研究人员和不同实验室的不同制剂结果时,请记住这一点。

结论

尽管有许多方法可用,但仍然缺乏关于如何最佳分离,定量,大小和表型表征外泌体的统一共识。在查看其他实验室的结果并将其与您的数据进行比较时请记住这一点。设计用于测量相同参数的不同技术(例如EV尺寸和浓度)通常产生稍微不同的结果。无论您使用何种方法和技术来获得所需的结果,请遵循这些建议的提示并与您的方法保持一致。