实验室规模蛋白质纯化

实验室规模的蛋白质纯化弥补了小规模探索性蛋白质纯化与高通量操作(如工业规模制造)之间的差距。在规模较大的一端,上游加工的进步,例如改进的发酵能力,导致可用于投入的原油样品量增加。尽管这意味着目标蛋白质的潜在产量更高,但它也对下游的及时和成本有效的样品处理提出了巨大的挑战。由于杂质含量较高导致规模增加,这一挑战变得更加困难 - 这是由于大规模细胞培养中发酵时间延长和细胞密度增加所致。

通常,在最初的探索性蛋白质纯化阶段进行了许多优化工作。在这里,您将确定您的目标蛋白质是否存在任何溶解度问题,从而缓解其中最快乐的问题,以及其纯化的基本策略。然而,在实验室规模阶段进行的工作对于在探索性和大规模蛋白质纯化之间成功转变至关重要。它使您能够研究如何增加工作量,而不会影响产品回收率或纯度。

通常,许多蛋白质纯化方案依赖于色谱的应用,无论处理的体积如何。实验室规模程序也不例外,这里的色谱过程可以分为三个主要阶段:目标蛋白质捕获,中间纯化和最终抛光[1]。这些阶段中的每一个阶段在处理工作流程中执行特定功能,因此在涉及流程设计时具有其自己独特的一组要点。同样,每个阶段在扩大规模期间都会遇到不同的挑战。本文讨论了开发实验室规模蛋白质纯化的下游工作流程时要考虑的重要因素,重点是色谱。

蛋白质捕获

蛋白质捕获的基本目标是尽可能快地收集和保留尽可能多的目标蛋白质,同时让不需要的杂质不受阻碍地流过分离介质。在此阶段,您选择的色谱树脂的分辨性质不如其对目标蛋白质的结合能力那么重要。

亲和色谱树脂通常用于蛋白质纯化的这个阶段。它们是靶蛋白富集的有效方法,可快速将它们与任何可能损害它们的杂质隔离。它们基于蛋白质对基质结合配体的吸引力而工作,并且这种相互作用可以由天然蛋白质部分介导或通过工程添加亲和标签。如果您的过程涉及外源标签,请仔细考虑如何在净化过程结束时将其去除。首先询问您是否需要删除标签; 通过蛋白酶处理去除标签可以为您的方案添加至少另一天。如果这是绝对必须的,请记住在下游工作流程中构建纯化步骤,完全删除标签,

如果您需要避免使用基于亲和力的纯化,因为您希望避免在目标蛋白质中引入标签,离子交换层析树脂可能是蛋白质分离的另一种选择。这些将在下面更详细地讨论。

无论您选择哪种捕获方法,请考虑此初始阶段将处理最大的样本输入量; 因此,需要相对较快的流速来保持工作流程的效率。选择具有良好流动特性的较大珠粒树脂(例如,非常亲水的珠粒材料)以改善整体加工时间而不损害粘合能力。当这个过程最终扩展时,这对你有利。

中间净化

在中间纯化阶段,目标蛋白的分辨率是一个更重要的优先事项。即使在上一步中已经去除了大量杂质,一些宿主细胞污染物仍会潜伏在样品中。在这个阶段,使用具有最佳珠粒尺寸的色谱树脂可能是诱人的,因为珠粒尺寸与最终产品分辨率相关; 然而,中等尺寸的珠子通常更适合于该过程的这个阶段。速度不太重要,因为任何会影响靶蛋白稳定性或活性的杂质都会在捕获步骤中被除去。但是,中等珠粒尺寸将在加工时间和纯度之间提供最佳折衷,因为它们仍然允许去除异质元素,例如电荷变体或截短蛋白质。

离子交换色谱是中间阶段纯化的常用选择。它根据电荷和相反电荷矩阵的吸引力捕获蛋白质。可以通过使用增加的离子强度或pH梯度或等度洗脱来进行分离,其中流动相保持不变但是基于极性促进物质通过基质的更快或更慢的通过。这些蛋白质分离的差异方法看到目标蛋白质在不同的洗脱窗口期间进入流动相,从而允许微调洗脱并进一步浓缩目标蛋白质。

您还应考虑在此中间阶段使用混合模式树脂。混合模式树脂由于其组成而具有独特的分离性能,其由多种分离方式组成。增加纯化过程中使用的分离方法的数量和种类会产生更高质量的最终产品。使用混合模式树脂简化了这种策略,为各种生物分子提供了无与伦比的选择性和分辨率。它还能够在较高盐浓度下加载样品,具体取决于目标蛋白质和所用的混合模式树脂。这消除了对离子交换色谱通常需要的缓冲液交换或透析步骤的需要,减少了总处理时间和样品损失的可能性。

最终抛光

在色谱的最终抛光阶段,主要目标是通过去除痕量污染物来实现目标蛋白的高分离度,并将其与任何不需要的结构变体分离。对于最终的抛光色谱,也建议使用小珠粒尺寸。请注意,使用较小的珠粒尺寸会导致压力增加; 在这种情况下,应使用较低的流速,这意味着处理时间可以更长。


尺寸排阻色谱(SEC)通常用于此目的,因为它可以去除任何挥之不去的杂质,但也可以处理化学上相似但结构上不合适的蛋白质种类,例如目标蛋白质的二聚体或降解形式。顾名思义,它是一种非结合技术,根据蛋白质的大小差异分离蛋白质。使用等度缓冲液作为标准,如果您想获得最佳分辨率,重要的是要考虑SEC基质只能处理低样品量负荷(平均≤矩阵体积的10%)。

最后一句话

实验室规模的蛋白质纯化为未来的加工成功奠定了基础,因此设计一个工作流程不仅可以产生最纯净的蛋白质产品,而且还可以保持未来的可扩展性。考虑在实验室规模实验中按照上述顺序使用色谱树脂。请记住,不同供应商的每种介质类别中都有各种树脂,因此在设计过程中考虑每种树脂的优缺点也是有益的。有些更适合实验室规模流程的需求。