选择台式离心机的技巧

液相色谱是一种广泛使用且值得信赖的样品分离方法,研究人员在目标纯化工作流程中使用该方法。分离的基础涉及移动样品(在溶液中)与固定相或固相的相互作用,所述固定相或固相将选择性地捕获,结合或与样品中的组分相互作用。色谱法  利用核酸,小分子和大分子以及蛋白质的多种化学和物理特性,从样品混合物中选择性地排除或捕获目标靶标。

基本原则

在大多数情况下,液相色谱法涉及使用填充并保持在柱中的小颗粒或树脂(也称为介质),也称为固定相。可以对这些颗粒进行物理或化学修饰,以提供在有时非常复杂的混合物中结合或排斥特定分子的特异性。这些色谱柱可以使用重力运行以移动溶液样品,但更常见的是它们在低,  中  或高压下操作 - 通过机械泵和有时专用仪器来控制样品流过色谱柱中的固定相。有多种色谱树脂可用于满足研究人员不断变化的需求,以满足不同的目标分子的需求。

液相色谱可以在分析和制备规模上进行。通过分析方法,目标通常是从复杂混合物中发现,识别并有时量化组分。制备液相色谱的重点是分离和纯化通常用于下游生物加工步骤的分子。

蛋白质纯化可能带来一些挑战,并且与任何纯化方案一样,需要协议优化。对于培养基选择有许多选择,并且每种色谱方法用于不同的目的,无论是更一般的分子选择还是高度特异性的分离。某些目标可能需要使用不同的色谱柱进行多个分离步骤,或采用多模式或混合树脂方法来满足研究人员的特定需求。

在这里,我们简要讨论一些用于蛋白质纯化工作流程的常见液相色谱方法,重点介绍每种方法的介质(树脂)和主要原理和注意事项。遵循的一般规则是以尽可能少的步骤获得目标蛋白质所需的纯度。

色谱和媒体选择

离子交换色谱
离子交换(IEX)色谱法根据分子的总电荷分离分子。该技术是一种功能强大的方法,可用于纯化的分析阶段和制备阶段。离子交换树脂通过将带正电或带负电的官能团共价连接到固体基质而产生。一些常用的基质包括纤维素,琼脂糖,聚甲基丙烯酸酯,聚苯乙烯和聚丙烯酰胺。将蛋白质样品以低离子强度加载到IEX柱上,然后用增加离子强度/盐的缓冲液洗涤以除去不需要的蛋白质和杂质; 使用确定的盐梯度或pH的变化洗脱目标靶蛋白。通过盐梯度洗脱依赖于带电盐离子与带电树脂的结合靶竞争的事实。具有较少带电基团的靶标倾向于在较低盐浓度下洗脱,具有较多带电基团的靶标在较高盐浓度下洗脱。缓冲条件对于该方法是关键的,并且样品通常在低盐条件下加载到柱上。对于某些样品,这可能需要在加载到IEX色谱柱之前进行缓冲液交换步骤。或者,通过pH洗脱利用靶蛋白的等电点(pI)。当呈现给样品的pH达到目标靶的pI时,它不再带有净电荷并被树脂释放。对于某些样品,这可能需要在加载到IEX色谱柱之前进行缓冲液交换步骤。或者,通过pH洗脱利用靶蛋白的等电点(pI)。当呈现给样品的pH达到目标靶的pI时,它不再带有净电荷并被树脂释放。对于某些样品,这可能需要在加载到IEX色谱柱之前进行缓冲液交换步骤。或者,通过pH洗脱利用靶蛋白的等电点(pI)。当呈现给样品的pH达到目标靶的pI时,它不再带有净电荷并被树脂释放。
对于诸如单克隆抗体的靶标,IEX是有效的第二纯化步骤; 亲和色谱(见下文)通常是纯化工作流程的初始步骤。对于非抗体分子,大珠IEX树脂是第一柱纯化步骤的良好起点。

疏水相互作用色谱
疏水相互作用色谱(HIC)基于其疏水性分离蛋白质。HIC通常用于分离或纯化蛋白质,同时保持其生物活性,因为该技术利用比其他纯化方法对样品变性更小的缓冲液,基质和参数。盐浓度,pH和温度都可以影响与介质的结合相互作用以及固定在树脂上的配体化学。该方法是互补的,通常与上游高盐IEX洗脱或下游大小排除(见下文)纯化程序结合使用。

尺寸排阻色谱法
尺寸排阻色谱法(SEC)通过凝胶过滤基于其大小分配蛋白质。凝胶由含有特定尺寸孔的球形珠组成,所述孔包括或排除来自介质内孔的分子。当蛋白质通过柱子时,蛋白质的分离按大小发生,并按分子量降低的顺序洗脱。最常用的两种SEC方法是分馏和脱盐/缓冲交换蛋白。SEC通常用于分离可能无法通过其他方法解析的蛋白质,例如IEX或HIC。研究人员可以选择保留SEC以进行最后的纯化步骤。

亲和层析
亲和层析利用固定在树脂上的配体与其结合配偶体之间的特异性结合相互作用。结合/纯化通常是高度选择性的并且利用靶蛋白的生物结构或功能。该方法的典型应用包括抗体/抗原,酶/底物和酶/抑制剂相互作用。通过该方法可以纯化天然以及重组产生的分子。除了提供更高的选择性外,由于特定的相互作用,亲和色谱可以提供更快的结果时间。根据具体的纯度目标,亲和色谱通常是纯化工作流程方案中的第一步,如果不是唯一的步骤。

多模式或混合模式色谱
多峰或混合模式色谱法利用已经用能够多重相互作用的配体官能化的树脂。当纯化不具有已知特异性的靶蛋白时,该方法是有用的。该树脂可用于筛选,纯化和潜在地鉴定靶蛋白上的位点,其可提供有用的亲和力和选择性信息。然而,由于存在多种结合和洗脱特性,因此不能通过简单的氨基酸序列分析预测目标相互作用,并且需要对结合和洗脱条件优化进行前期实验。该技术的主要优点是在单一介质中结合互补色谱方法,可以节省纯化步骤和珍贵的样品材料,同时还可以提供更快的结果时间,

蛋白质纯化的许多选择

从复杂样品中分离目标蛋白质可能非常具有挑战性。纯化步骤是进一步表征和理解靶蛋白功能的关键和必要过程。优化工作流程过程涉及许多变量。通常,最好从目标的一级氨基酸序列开始。这将提供有关分子量(作为SEC指南)和pI(作为IEX指南)的信息,并帮助预测和“评分”蛋白质的溶解度特征。选择合适的色谱介质以及洗涤和洗脱缓冲液条件可以极大地帮助纯化过程。当目标靶的性质未被充分理解时,还存在多峰或混合模式树脂。如需其他帮助,疏水性图和二级结构预测也可以在考虑HIC或混合模式树脂时提供指导。具有无序二级结构的靶(特别是在末端)通常不稳定或易于聚集,并且它们与HIC介质良好相互作用。