显微镜相机:你可以只用一个吗?

过去十年中显微镜摄像机的进步现在可能意味着,对于绝大多数生物科学应用而言,实验室可以放弃仅投资一台高性能摄像机,该领域的**专家之一Simon Watkins,杰出教授和副教授匹兹堡大学细胞生物学教授,免疫学教授,创始人兼生物成像中心主任。

“目前几乎所有生物科学用途的**佳解决方案是单色科学CMOS [互补金属氧化物半导体]相机,”沃特金斯补充道。这与几年前相比发生了巨大的变化,当时CCD [电荷耦合器件]相机是显微镜相机的主要支柱。

CMOS(或sCMOS)和CCD都是数码相机中的成像传感器 - 相当于标准35mm胶片相机中的一块胶片。按下快门时,光线进入相机,显微镜上的图像(或任何其他图像)会曝光到传感器上。CCD按顺序转换构成图像的像素的测量值,而CMOS同时进行转换。“这意味着CCD的读数通过单个节点推动,因此当您向传感器添加更多像素时,您的**大帧速率会下降,”生物系统产品经理Nathan Claxton说道,尼康仪器公司的成像部门。“另一方面,使用科学CMOS,你不一定要牺牲像素的速度。”

当大约十年前科学CMOS**出现时,由于CMOS的灵敏度限制,CCD相机仍然主导着显微镜市场。早期的CMOS相机具有正面照明,这意味着它们的量子效率(QE) - 每个像素检测到的入射光子的比例 - 必然是有限的。背光照明技术 - 后透薄技术 - 早已可用于CCD相机,在超低光应用中具有优势。

前照式CMOS设备仍然是非常有用的相机,当然比传统的CCD相机更好。然而,在过去两年中,出现了**新一代背照式科学CMOS相机,QE大于95%,并且所有相同的低读取噪声和高帧率**初吸引前照式CMOS用户相机 - 基本上取代了CCD相机。“不到五年前,CCD仍然是我们**受欢迎的显微镜相机。但现在,科学的CMOS已经取代了它,“克拉克斯顿说。

显微镜成像的标准三角形是分辨率,速度和灵敏度。

“显微镜成像的标准三角形一直是分辨率,速度和灵敏度。过去,如果你想在三角形上找到更多的东西,你总是不得不放弃其中一方,“卡尔蔡司显微镜北美产品营销组经理Scott Olenych说。“如果你想要更快的速度,你必须放弃灵敏度或分辨率。但你可以说sCMOS扩大了这个三角形 - 而不是选择一个或两个边,你可以让它们更好。“

因此,沃特金斯博士建议,今天用户可以选择单个相机来满足他们所有的显微镜成像需求 - 也许,除了一些利基用途,如旋转盘共聚焦显微镜和单分子成像。

但是颜色怎么样?如果您只进行明场成像,光线充足,那么彩色相机的QE通常较低也不成问题。但是当在低光下使用荧光样品时 - 例如全内反射荧光(TIRF)显微镜 - 彩色相机不是您的**佳选择。因此,如果您使用的是两用显微镜,那么您不需要两个不同的相机吗?

STORM超分辨率图像
有一种更简单(也更便宜)的解决方案:使用单色sCMOS相机并将其与高速三色透照光源(二极管)配合使用,可以在红色,绿色和蓝色波长之间切换。“它收集来自三个颜色通道的图像,我所知道的每一块商业软件都可以自动将它们组合在一起并平衡颜色,为您提供彩色图像,”沃特金斯说。

**款带有背薄传感器的sCMOS相机进入市场的是Photometrics的Prime 95B,这是一款144万像素的摄像头,可提供95%的QE(相比前照式sCMOS摄像头的60-80%QE)。2017年11月,该公司发布了400万像素的Prime BSI。“Prime相机提供了近乎**的灵敏度,并允许研究人员专注于相机的其他性能方面。这两款相机的主要区别在于Prime 95B的像素比素有更大的像素,而BSI的像素更小,但更多像素,“Photometrics的科学产品经理Rachit Mohindra解释道。“使用较小的像素,Prime BSI成为空间分辨率的更好选择,可以看到更精细的功能。95B具有更大的像素,对于更高的放大倍率和进一步**大化的灵敏度变得更好。“

图像:使用Prime 95B Scientific CMOS相机拍摄的STORM超分辨率图像。细胞类型:U2OS细胞。曝光时间:30毫秒。放大倍数:150倍(配置像素大小~73纳米)。使用的重建算法:单PSF拟合的**大似然估计(MLE)方法。图片由纽约大学医学院的Yandong Yin和Eli Rothenberg提供。

目前,Photometrics凭借目前**可用的背面薄型sCMOS相机在该领域占据主导地位,但随着其他制造商进入这个竞争激烈的领域,这种情况很快就会发生变化。

但是暂时不计算CCD。“CCD相机仍然是显微镜成像的重要组成部分,用于成千上万的显微镜,而且每年都会购买很多显微镜,”Olenych指出。“由于相对较低的成本和多功能性,它们是许多人选择用于显微镜成像需求的相机选项。”

此外,对于旋转盘共聚焦显微镜或单分子研究中的低光成像,一些用户可能仍然更喜欢电子倍增CCD相机,它使用片上倍增增益来实现单光子检测灵敏度,而不会影响QE或分辨率。“这是一款研究级相机,永远用于这两种应用。但老实说,即使在这些情况下,我也会争辩说,任何考虑购买新相机的人都应该考虑新的背面薄型sCMOS相机,“沃特金斯博士建议道。“你真正想要一个EMCCD相机的**时间是你**需要放大电路,这可能会产生噪音问题。”

在某些情况下,例如在共聚焦显微镜上使用基于阵列的探测器,或者在处理非常快的低光时,用户仍可能发现EMCCD更好。**可以确定的方法是:将两台摄像机放入您将使用它们的环境中,然后测试它们。“这是购买显微镜相机的主要信息:测试一切,买一次,”沃特金斯博士警告说。“我看到大量买家对这些相机的懊悔。请您的供应商让您在现实世界的实验室条件下测试您正在考虑的相机。“

在经过深思熟虑的科学CMOS的大跃进之后,显微镜相机技术的下一步是什么?“到目前为止,制造商之间的竞争一直是提高相机的速度,同时增加量化宽松,”克拉克斯顿说。“现在许多sCMOS相机的QE为95%,你不能再远离那里了。随着更多背照式sCMOS相机的推出,它们将达到这个极限。在短期内,我们可能会看到将高QE与低噪声相结合,同时使像素更小 - 一个大视场,但不要牺牲分辨率来做到这一点。短期内的梦想是以非常高的分辨率看待事物,但是在很大的范围内。“