超分辨率显微镜选项

在显微镜中,一个重要的持续目标是希望更清楚地看到较小的东西。由于光的衍射极限,传统的光学显微镜面临大约200-250纳米的分辨率极限。为了观察样品的较小特征,科学家们可以应用超分辨率显微镜,它可以显示尺寸仅为几十微米的细节。这些用于成像样品的新技术提供的分辨率曾经看起来太好了,不能真正打破看似牢不可破的障碍。科学家必须考虑这些方法的优缺点,然后找到**适合特定研究目标的方法。

通常,超分辨率显微镜包括一些不同类型的技术,例如受激发射耗尽显微镜(STED)。另一种超分辨率方法是单分子定位显微镜,包括光活化定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM)。一些科学家还将结构化照明显微镜(SIM)添加到超分辨率方法列表中,但其他人会说这种技术无法比共聚焦显微镜更好地成像。

本文将简要介绍这些技术的工作原理。在STED显微镜中,激光在非常有限的区域或焦点上打开和关闭荧光标记。然后,这些激光扫描样品以产生图像。在某些情况下,STED可以与活细胞成像相结合。对于PALM和STORM,荧光团也不会同时被激活。以这种方式,荧光标记以可用于构建极高分辨率图像的序列打开。然而,PALM和STORM都不是活细胞成像的理想选择,但这些方法可以相对容易地转变为平台。SIM技术创建了在图像上移动的网格状光图案,然后傅立叶变换用于生成图像。

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鉴于这项技术被称为超级分辨率,它有多好?简短的回答是:比普通光学显微镜更好。因此,这意味着超分辨率显微镜必须提供可以分辨小于200纳米的细节的图像。但是,有些方法比其他方法更好。SIM的分辨率约为100纳米,约为普通光学显微镜的两倍。对于STED,一些平台提供30纳米分辨率的活细胞,15个细胞固定。通过PALM或STORM,科学家们可以看到仅约15纳米的细节。

更好的成像不仅仅是更好的分辨率。

正如已经指出的那样,更好的成像不仅仅是关于更好的分辨率。目标是看到更小的东西,并能够描述和解释它们是什么。因此,超分辨率显微镜的信噪比也很重要。更高的信噪比可以创建更清晰的图像,而这可能是**重要的。具体的比较取决于所使用的特定平台,样品和成像条件,但差异可能很大。例如,牛津大学**成像部门经理Ian Dobbie及其同事表示,  SIM在一次比较中产生的信噪比是STED的900多倍。对于科学家来说,知道什么是signal-t0-noise是可能的,有时只需要比较几种或更多种方法。

时间考虑因素也起作用。如果科学家需要了解某些东西是如何移动的,那么**好的选择就是它取决于它。如果事情很重要,SIM可以非常快速地跟踪运动,但它不能提供足够的分辨率来对分子进行分析。STED可用于跟踪,速度取决于图像的大小,因为STED扫描它。PALM和STED也可以跟踪动态事件,但不是很快,因为这些方法将数千个图像合并为一个。

除了基本技术,科学家们不断扩展超分辨率显微镜的功能,这里有几个**近的例子。

修改方法

要真正了解生物系统如何工作,必须在上下文中查看组件,这可能需要三维(3D)成像。一些技术以高分辨率提供3D成像,但对样本不是很深。因此,LaboratoirePhotoniqueNumériqueetNanosciences的研究员Pierre Bon和他的同事开发了一种名为SELFI的方法,他们将其描述为“多细胞标本和组织中3D单分子定位的框架。”使用这种技术,科学家们成像肌动蛋白丝在样品表面下方低**50微米。在这项工作中,科学家们使用了球体 - 细胞的3D培养物 - 这些材料甚**不需要在这些深度进行成像清除。

如上所述,在某些应用中可能需要在空间和时间上进行成像。这可以通过各种方式完成,并且新方法不断涌现。**近,洛桑联邦理工学院生物医学光学实验室负责人Theo Lasser建立了一个结合3D超分辨率显微镜和3D相位成像的平台,可用于绘制细胞甚**细胞器,科学家称之为一台4D显微镜。

科学家可以购买一个,而不是建立超分辨率系统。例如,尼康生产的N-SIM超分辨率显微镜可用于活细胞成像,每秒可拍摄15帧。来自奥林巴斯的科学家们可以购买IXplore SpinSR10超分辨率成像系统,该系统专为活细胞成像而设计,可提供120纳米的分辨率。尼康和奥林巴斯系统都可以在不同形式的成像之间切换。例如,奥林巴斯文献指出IXplore SpinSR10可以“在超分辨率,共焦和宽场成像之间切换。”为了探索多个细节,科学家们可以从徕卡显微系统中选择HyVolution 2,它可以提供140纳米的分辨率并成像多个荧光团。超分辨率系统甚**不需要占用大量实验室空间。例如,GE Healthcare将其DeltaVision OMX SR描述为“专门为结构化照明显微镜(SIM)超分辨率技术提供稳定平台的紧凑型成像系统”,并且可用于多种模式进行活细胞成像,包括动态图像捕获。 这只是一小部分可用选项。

在进入超分辨率显微镜之前,要做出的各种决策和需要考虑的技术需要科学家进行一些研究,但对研究的影响可以使时间得到很好的投入。科学家在样本中可以辨别的细节越多,我们就能越了解周围的世界。