超分辨率显微镜显示惊人的细节

使用传统的光学显微镜,光的衍射将成像分辨率限制在约250纳米。在下面提到的一种方法中,超分辨率技术有时可以将其提高10倍或更多。今天,这项技术涉及多种方法,但主要有三种:单分子定位显微镜,包括光活化定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM); 结构照明显微镜(SIM),虽然一些专家指出,SIM的分辨率只能与良好的共聚焦显微镜相媲美; 和受激发射损耗显微镜(STED)。

“不幸的是,决定采用哪种超分辨率方法并没有简单的规则,”英国牛津大学的Henry Wellcome博士后,Mathew Stracy说。“每个人都有自己的优点和缺点。”

科学家们使用各种技术为特定项目选择正确的方法。“找到解决问题的最简单的解决方案,”海法以色列理工学院Technion生物医学工程助理教授Yoav Shechtman说。“在生物成像环境中,关键考虑因素包括:所需的空间和时间分辨率,对光损伤的敏感性,标记能力,样品厚度 - 这是2D还是3D问题? - 背景荧光水平,或细胞自发荧光。”

超级资源的ABCs

超分辨率显微镜的形式以不同的方式工作。例如,对于PALM和STORM,在任何给定时刻,只有一小部分分子上的荧光标记被打开或光活化,从而允许它们以高精度独立定位。对所有荧光标记执行此过程可构建完整的超分辨图像。“PALM / STORM系统相对容易构建,但更难以应用,因为荧光团必须是可光活化的,”马克斯普朗克生物物理化学研究所主任,2014年诺贝尔化学奖获得者之一Stefan Hell说。用于超分辨率成像。“他们的局限在于他们需要在细胞背景中检测单个荧光分子。”他补充说,这些技术“使用的可靠性不如STED”。

使用SIM,光的干涉图案在成像期间在样品上产生网格。基于傅里叶变换的图像和算法之间的网格转换使用结果信息来定位特征。

STED使用激光脉冲打开荧光团,另一个打开荧光团。在样本上扫描焦点以生成图像。“STED的优势在于它是一种按键技术,”Hell解释道。“它几乎可以像标准的共聚焦荧光显微镜一样使用。”它还能用一些荧光团成像活细胞,如绿色或黄色荧光蛋白和硅罗丹明衍生染料。

埃默里大学的助理科学家尼尔·安东尼在考虑使用哪种超级分辨率时说,“这一切都必须逐案考虑。”他指出,PALM和STORM“对活细胞不太好” ,“但STED可用于活细胞或固定细胞。

评估参数

尽管所有超分辨率技术都超过了传统光学显微镜的分辨率,但有些技术比其他技术获得了更多的收益。SIM大致将分辨率提高一倍,降至约100纳米。PALM和STORM可以解析大约15纳米的特征。地狱表示,STED“可以在活细胞中提供低至30纳米的空间分辨率,在固定细胞中提供15纳米的空间分辨率。”

在评估具体应用时,还必须考虑单噪比。在某些情况下,较低的分辨率但较高的单噪比会产生比更好的分辨率更好的图像,但会降低单一噪声比。

获取图像的速度在某些应用中很重要,尤其是具有活细胞的应用。“所有的超分辨率技术都比传统的荧光成像慢,”Stracy说。“PALM / STORM是最慢的,需要数万帧才能获得单个图像,SIM每张图像需要数十帧,而STED是一种扫描技术,因此采集速度取决于视场的大小。”

Biocompare的显微镜搜索工具
查找,比较和评论
来自不同供应商的显微镜搜索

除了成像活细胞或固定细胞外,一些科学家还想知道事物是如何移动的。例如,Stracy“对观察活细胞中生物系统的动态感兴趣,而不仅仅是静态图像,人们通常将其与显微镜联系起来。”他可以用PALM结合活细胞中的单粒子跟踪来分析动力学。通过这种方式,Stracy说他可以“直接跟踪标记分子,因为它们在细胞中发挥作用。”STED加荧光相关光谱也可用于观察标记分子在STED成像体积中移动。“另一方面,SIM不适合研究这些分子水平的动态过程,但由于它的获取速度相对较快,因此非常适合观察细胞中较大结构的动态,例如整个染色体,几分钟后,“他说。

一到一个

2017年,Hell的团队报道了MINFLUX超分辨率显微镜。1 “这种超分辨率方法通常在真正的分子尺度上实现了第一次空间分辨率,1纳米,”Hell说。“此外,它允许跟踪活细胞中的单个分子,其速度至少比以前任何其他方法高100倍。”

MINFLUX

MINFLUX-具有1纳米的分辨率 - 清楚地分辨出八个彼此分开约11纳米的不同分子。(图片由Francisco Balzarotti,Yvan Eilers,Klaus Gwosch,ArvidGynnå,Volker Westphal,Fernando Stefani,Johan Elf和Stefan Hell提供。)

其他科学家也宣称了MINFLUX超分辨率显微镜的价值。根据Shechtman的说法,“新的应用程序和方法开发不断涌现,但我想到了两个令人兴奋的进展。”他说,其中一个是MINFLUX。他说,在描述它的好处时,“利用一种巧妙的方法,以极高的精度和非常有限的光子预算获得分子定位。”

作为第二个令人兴奋的近期进展,Shechtman指出,WE Moerner--也是2014年诺贝尔化学奖的超分辨率成像获奖者之一 - 以及他的斯坦福大学同事改进了成像分辨率,这可能受到各向异性发射的限制。荧光单分子。为了解决这个问题,Shechtman说,Moerner实验室的科学家们通过使用不同的激发极化来测量分子的取向及其位置。或者,他们开发了复杂的光瞳平面工程,完全消除了方向诱导的定位偏差。“ 2-4这些技术提高了定位结构的能力。

看着标签

在许多超分辨率应用中,标签确实有所不同,并且存在一些商业选择。例如,总部位于德国的Miltenyi Biotec与Stefan Hell联合创办的初创公司Abberior合作,为超分辨率显微镜染料提供定制抗体结合服务。

在许多超分辨率应用中,标签确实有所不同,并且存在一些商业选择。

其他公司也提供适用于超分辨率显微镜的标签。例如,ChromoTek营销部门的Christoph Eckert说:“我们的Nano-Boosters非常小 - 大约15千道尔顿 - 并且具有高度特异性。”这些蛋白质与绿色和红色荧光蛋白(分别为GFP和RFP)和波形蛋白结合。结合蛋白。“结合蛋白来源于单域羊驼抗体片段,称为V H Hs或纳米体,”Eckert解释说。“这些V H Hs结构域非常小,具有优异的结合特性,并且可以在不进行批次间变化的情况下以恒定的高质量生产。”

这些标签的大小在超分辨率显微镜中有所不同。与荧光染料相结合,V H Hs是超分辨率的有用工具。正如埃克特指出的那样,“小于2纳米的表位 - 标记位移可以最大限度地减少连锁误差。”他补充说,“传统检测系统的荧光团距离更远,通常为15-30纳米。”这些标签适用于一系列超级分辨率技术,包括SIM,PALM,STORM和STED。

马里兰大学医学院助理教授唐爱慧及其同事使用ChromoTek的GFP-Booster和STORM来探索神经系统的信息传递。5在突触 - 神经元交流的地方 - 作者在突触前和突触后神经元中发现了分子的纳米团簇,这些分子形成了他们所描述的纳米柱。科学家得出结论:“这种结构提示了中枢神经系统突触的简单组织原理,以维持和调节突触效率。”

超分辨率成像的版本和越来越多的方法将继续为科学家提供更接近生物学的观点。在某些情况下,生物学家甚至可以观察细胞的作用 - 同时打破可见光的衍射极限。

参考

1 Balzarotti,F,et al。“具有最小光子通量的荧光分子的纳米分辨率成像和跟踪”,Science 355:606-612,2017。[PMID:28008086 ]

2 Backer,AS,et al。“使用超分辨率显微镜和同时单分子定向测量增强DNA成像,”Optica 3:3-6,2016。[PMID:27722186 ]

3 Backlund,MP,et al。“使用宽带超曲面掩模去除单分子显微镜中取向诱导的定位偏差”,Nature Photonics 10:459-462,2016。[PMID:27574529 ]

4 Lew,MD,Moerner,WE。“方位角偏振滤波,用于精确,精确,稳定的单分子定位显微镜。”Nano Letters 14:6407-6413,2014。[PMID:25272093 ]

5 Tang,AH,et al。“跨突触纳米柱将神经递质释放与受体结合,”Nature 536:210-214,2016。[PMID:27462810 ]